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IE6-A2細(xì)胞【SX1412-D】復(fù)蘇步驟注意事項：

【材料】1.  常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)儀器設(shè)備 恒溫水浴振蕩器。  2.  培養(yǎng)液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亞砜（DMSO）

【操作程序】  1.  細(xì)胞實驗室進(jìn)行常規(guī)**，紫外照射40min以上。 2.  培養(yǎng)液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱370C預(yù)熱20min，備用。 3.  二甲基亞砜（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，備用。  4.  從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400C水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。 5.  將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min，5min）。 6.  用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，方培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 7.  記錄復(fù)蘇日期。

IE6-A2細(xì)胞【SX1412-D】【注意事項】  1.  取細(xì)胞的過程中注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。此項尤為重要，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。  2.  凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細(xì)胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細(xì)胞的毒副作 較大，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復(fù)蘇溫度太慢，會造成細(xì)胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）*好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。  3.  離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細(xì)胞的損傷。  4.  離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，**天換液。因為離心的目的是兩個，去除 DMSO，去除死細(xì)胞，這個是標(biāo)準(zhǔn)流程，但對一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時間，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過了活細(xì)胞會受壓過大， 死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細(xì)胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液 體前倒凈，且一定倒干凈。我在試驗中按照常規(guī)的離心分裝的方法進(jìn)行復(fù)蘇，結(jié)果無有異常。  5.  細(xì)胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細(xì)胞解凍時1ml細(xì)胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液，而在我的試驗中的經(jīng)驗總結(jié)為培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。  6.  復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問題：試驗中我的經(jīng)驗總結(jié)為復(fù)蘇1管細(xì)胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多，細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁。  7.  加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大，就會影響 細(xì)胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候?qū)σ话慵?xì)胞沒有什么影響，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。

IE6-A2細(xì)胞【SX1412-D】 一、原理 在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。 細(xì)胞復(fù)蘇時速度要快，使之迅速通過細(xì)胞*易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。 目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。 二、操作步驟 （一）凍存 1、消化細(xì)胞（同實驗二），將細(xì)胞懸液收集至離心管中。 2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。  3、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng)，計數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右。 4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。  5、將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時易出現(xiàn)爆裂。 6、貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。  7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。  注意：操作時應(yīng)小心，以免液氮**。液氮定期檢查，隨時補(bǔ)充，**不能揮發(fā)干凈，一般 30立升的液氮能用1～1.5月。 （二）復(fù)蘇  1、準(zhǔn)備一個茶缸或1000ml的燒壞，內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水。  2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。 3、打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。 4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。  5、沉淀加 10ml培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。  6、加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，**天觀察生長情況。 三、試劑和器材  器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機(jī)等 試劑：0.25％胰酶、培養(yǎng)基、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基（即凍存液） 附：凍存液配制：  培養(yǎng)基加入甘油或DSMO，使其終濃度達(dá)5—20%。保護(hù)劑的種類和用量視不同細(xì)胞而不同。配好后4℃下保存。

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